ГОСТ 32477-2013 Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Определение биоаккумуляции на придонных малощетинковых червях

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ
СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ
ПРОДУКЦИИ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ
ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Определение биоаккумуляции на придонных
малощетинковых червях

(OECD,Test № 315:2008, IDT)

Издание официальное

Москва
Стандартинформ
2014

Предисловие

Цели, основные принципы и порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации
установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и
ГОСТ 1.2 - 2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные,
правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия,
применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

За принятие проголосовали:

Перевод с английского языка (еп).

Степень соответствия - идентичная (IDT).

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информа-
ционном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячном
информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или от-
мены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесяч-
ном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация,
уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на
официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в
сети Интернет

© Стандартинформ, 2014

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично вос-
произведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Феде-
рального агентства по техническому регулированию и метрологии

Введение

Эндобентос, потребляющий донные отложения, может подвергаться воздействию химических
веществ, содержащихся в них (1]. Среди подобных организмов, потребляющих донные отложения,
большое значение имеют водные олигохеты (малощетинковые черви), обитающие в придонных слоях
водных систем. Данные организмы обитают в осадочных отложениях и часто являются наиболее
многочисленными, особенно в местах с неблагоприятными экологическими условиями для других ор-
ганизмов. Поскольку данные животные проводят биотурбацию осадка и являются пищей для других
организмов, водные олигохеты могут оказывать сильное влияние на биодоступность химических ве-
ществ для других организмов, например бентосных рыб. В отличие от эпибентосных организмов эн-
добентосные водные олигохеты роют норы в осадке и потребляют частицы нижнего (неповерхностно-
го) слоя осадка. По этой причине данные организмы подвержены воздействию химических веществ
различных путей поступления, в том числе в результате прямого контакта, употребления в пищу за-
грязненных частиц осадка, поровой воды и воды водного объекта. Некоторые виды донных олигохет,
которые в настоящее время используют в эко-токсикологических испытаниях, описаны в приложении
А.

Параметры, характеризующие биоаккумуляцию вещества, включают прежде всего фактор
биоаккумуляции (BAF), константу скорости поглощения осадка ks и константу скорости выведения ке.

Для оценки потенциала биоаккумуляции химических веществ в целом, а также для изучения
биоаккумуляции веществ, которые имеют тенденцию к распределению на поверхности и 8 толще
осадка, необходим специальный метод испытания [1}-(4J.

ГОСТ 32477—2013

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ
ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Определение биоаккумуляции на придонных малощетинковых червях

Testing of chemicals of environmental hazard. Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochaetes

Дата введения — 2014—08—01

Настоящий стандарт устанавливает методы для оценки биоаккумуляции содержащихся в
осадке (связанных) химических веществ на малощетинковых червях. Исследуемое вещество вводят в
осадок. Использование такого осадка предназначено для имитации загрязненных отложений.

Описываемый метод используют для стабильных, нейтральных органических химических ве-
ществ, которые включаются в осадок. Рассматриваемый метод используют для оценки биоаккумуля-
ции ассоциированных с осадком, стабильных металлорганических соединений [12]. Метод не приме-
ним для металлов и других микроэлементов [11] без изменения структуры испытания в части суб-
страта и объема воды и, возможно, размера образца.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определения-
ми:

Издание официальное

Кроме того, может быть необходима следующая информация при наличии:

Для использования должны быть доступны соответствующий аналитический метод с извест-
ной точностью и чувствительностью для количественного определения вещества в тестовых раство-
рах, осадке и в биологическом материале, а также информация о подготовке и хранении образцов и
паспорт безопасности вещества. Должны быть известны аналитические пределы обнаружения ис-
следуемого вещества в воде, осадке и тканях тестового организма. Если используется маркирован-
ное вещество, также должны быть известны удельная радиоактивность (т е. ftyx.vto.ib1), положение
меченого атома и процент радиоактивности, связанный с примесями. Удельная радиоактивность ис-
следуемого вещества должна быть как можно выше для возможности обнаружения как можно более
низких тестовых концентраций [11 ].

Должны быть известны информация о характеристиках осадка, который будет использоваться

((например, происхождение осадка или его компонентов, pH и концентрация аммиака в поровой воде
(полевые отложения)], содержание общего органического углерода (ООУ), распределение частиц по
размерам (соотношение песка, ила и глины) и сухой остаток [6].

Существует также взаимосвязь между содержанием липидов в тестовой рыбе и наблюдаемой
биоаккумуляцией подобных веществ. Для донных организмов были установлены аналогичные корре-
ляции [15] - [18]. Если доступно достаточное количество ткани червя, содержание липидов в тестовых
организмах может быть определено с использованием того же биологического материала, что и для
определения концентрации исследуемого вещества. Тем не менее целесообразно использовать акк-
лиматизированных контрольных животных по крайней мере в начале или предпочтительно в конце
фазы поглощения для измерения содержания липидов, которые затем могут быть использованы для
нормализации значений BAF.

Для того чтобы испытание могло считаться достоверным, должны быть выполнены следую-
щие условия:

Для получения достаточного количества червей для проведения испытания червей необходи-
мо содержать постоянно в отдельной лабораторной культуре. Лабораторные методы культивирова-
ния отдельных тестовых видов приведены в приложении А. Для более подробной информации см.
ссылки [8- [10],[18],[28] - (32].

Следует проявлять осторожность, чтобы избежать использования в оборудовании материа-
лов, которые могут растворять, поглощать исследуемое вещество или вступать с ним в реакцию и
оказать тем самым негативное влияние на тестовые организмы. Могут быть использованы стандарт-
ные прямоугольные или цилиндрические камеры, изготовленные из химически инертного материала
и подходящие емкости в соответствии с величиной загрузки, то есть количеством тестовых червей.
Следует избегать использования мягких пластиковых трубок для введения воды или воздуха. Теф-
лон®. нержавеющая сталь и/или стекло следует использовать для любого оборудования, вступающе-
го 8 контакт с тестовой средой. Для веществ с высоким коэффициентом адсорбции также может быть
необходимо использование таких веществ, как синтетические пиретроиды, силанизированные стекла.
В этом случае оборудование должно быть уничтожено после использования (5). Для маркированных
веществ и летучих химических веществ следует соблюдать осторожность, чтобы не допустить утечки
исследуемого вещества. Необходимо использовать ловушки (например, стеклянные бутыли для
улавливания газа), содержащие подходящие абсорбенты для удержания любых остатков, испаряю-
щихся из тестовых камер [11].

Дополнительная информация о поглощении осадка может быть получена с помощью методов,
описанных в [35] - [36], которые определяют поглощение осадка или распределение в тестовых орга-
низмах. Если же наблюдается по крайней мере наличие или отсутствие фекальных шариков на по-
верхности осадка, указывающих на поглощение осадка червями, результаты испытания должны быть
зарегистрированы и обработаны в отношении возможных путей воздействия.

Обработка природных осадков до их использования в лаборатории описана в [1], [6], [44]. Под-
готовка искусственного осадка описана в приложении О.

Период хранения природного осадка в лаборатории должен быть как можно короче. Рекомен-
дуется хранить осадок в течение максимум восьми недель при температуре (4 ± 2) °C в темноте. В
контейнерах для хранения осадка не должно быть свободного пространства для воздуха. Рекоменда-
ции по хранению искусственных осадков приведены в приложении Г.

В целях оптимизации условий результирующего теста (например, для выбора концентрации
исследуемого вещества, продолжительности фазы поглощения и выведения) может быть полезно
провести предварительное испытание. Поведение червей (например, избегание осадка, то есть когда
черви не зарываются в осадок, что может быть обусловлено присутствием химического вещества
и/или непосредственно самим осадком) должно быть учтено и зарегистрировано во время предвари-
тельного теста. Избегание осадка также может быть использовано в качестве сублетального пара-
метра в предварительном испытании для оценки концентрации исследуемого вещества для исполь-
зования в исследовании биоаккумуляции.

Подопытные организмы подвергаются воздействию исследуемого вещества во время фазы
поглощения. Первый образец следует отбирать по прошествии 4 - 24 ч после начала фазы поглоще-
ния. Фаза поглощения должна быть запущена на срок до 28 дней [1], [6], [11], если невозможно про-
демонстрировать, что равновесие было достигнуто ранее. Устойчивое состояние возникает, когда:

• три последовательных анализа BAF, проведенные на образцах, взятых с интервалом не ме-
нее двух дней, составляют не более чем ± 20 % друг от друга;

Первый образец следует отбирать по прошествии от 4 до 24 ч после начала фазы выведения,
поскольку 8 начальный период могут произойти быстрые изменения в тканях. Фазу выведения реко-
мендуется прекращать либо когда концентрация исследуемого вещества составляет менее 10 % рав-
новесной концентрации, либо по истечении 10 дней - максимальной продолжительности фазы. Оста-
точный уровень вещества в червях в конце фазы выведения используется в качестве второй конеч-
ной точки. Данный период может регулироваться периодом, в течение которого концентрация иссле-
дуемого вещества в червях остается выше аналитического предела обнаружения.

В связи с низким содержанием питательных веществ в искусственном осадке осадок должен
быть кондиционирован за счет источника пищи. Для того чтобы не допустить ошибки воздействия на
8

тестовые организмы, например, путем выборочного кормления незагрязненной пищей, пища, необхо-
димая для размножения и роста тестовых организмов, должна быть добавлена к осадку один раз пе-
ред или во время внесения исследуемого вещества (приложение Г).

Рекомендуемое соотношение осадок-вода составляет 1:4 [45]. Данное соотношение считает-
ся пригодным для поддержания концентрации кислорода на соответствующем уровне и предотвра-
щения накопления аммиака в надосадочных слоях воды. Содержание кислорода в вышележащих
слоях воды следует поддерживать на уровне не менее 40 % насыщения. Надосадочные слои воды в
тестовых сосудах должны быть аккуратно аэрированы (например, 2-4 пузырька в секунду) с помо-
щью пипетки Пастера, расположенной примерно на 2 см выше поверхности грунта так, чтобы мини-
мизировать взбалтывание осадка.

Фотопериод при культивации и проведении испытания составляет 16 ч [1]. [6]. Интенсивность
освещения в тестовой зоне должна сохраняться на уровне около 500-1000 лк. Температура должна
составлять (20 ± 2) °C на протяжении всего теста.

Одну тестовую концентрацию (как можно более низкую) используют для определения кинети-
ки поглощения, также может быть использована вторая (более высокая) концентрация (например,
[46]). В таком случае образцы отбирают и анализируют в равновесном состоянии или по прошествии
28 дней для подтверждения того, что BAF оценивается по наименьшей концентрации [11]. Наиболь-
шую концентрацию следует выбирать так, чтобы исключить негативное воздействие.

Пример - Выбирают примерно 1 % наименьшей из известных хронических концентраций ЕСх
как производных из соответствующих исследований токсичности.

Наименьшая тестовая концентрация должна быть значительно выше, чем предел аналитиче-
ского обнаружения вещества в осадках и биологических образцах. Если эффективная концентрация
исследуемого вещества близка к аналитическому пределу обнаружения, рекомендуется использова-
ние маркированного исследуемого вещества с высокой удельной радиоактивностью.

В течение фазы поглощения и фазы выведения должны быть измерены по крайней мере сле-
дующие параметры качества для поверхностной воды:

Пример • Суспендируют осадок с надосадочной водой и переносят содержимое каждого сосуда
в лоток, затем выбирают червей с помощью мягкого стального пинцета. Червей быстро промыва-
ют водой в мелком стеклянном или стальном лотке. Избыток воды удаляют.

Затем червей аккуратно переносят в предварительно взвешенные сосуды для взвешивания.
Червей замораживают (например, при температуре менее или равной минус 18‘С). Наличие и коли-
чество коконов и/или ювенильных особей должно быть зарегистрировано.

Кривую поглощения исследуемого вещества получают путем построения в арифметической
шкале зависимости концентрации исследуемого вещества 8/на червях во время фазы поглощения от
времени. Если кривая достигает плато, вычисляют BAFse в равновесном состоянии:

* С$ в равновесном состоянии или на 28-й день (среднее).

к.

Определяют BAFK как отношение —. ке как правило, определяют из кривой выведения (то

к.

есть графика зависимости концентрации исследуемого вещества в червях от времени во время фазы
выведения). к8 затем рассчитывают из кинетики кривой поглощения. Предпочтительный метод для
получения BAFK и констант кь и ке заключается в использовании нелинейного метода оценки (прило-
жение В). Если кинетика фазы выведения не первого порядка, то следует использовать более слож-
ные модели [25], [27]. [52].

Фактор аккумуляции в биоте-осадке (BSAF) определяют путем деления BAFK на содержание
липидов в черве и общее содержание органического углерода в осадке.

Результаты следует рассматривать с осторожностью, если измеренные значения концентра-
ции исследуемого вещества оказываются на уровнях, близких к пределу аналитического обнаруже-
ния.

Четко определенные кривые поглощения и выведения являются указанием на достоверность
и хорошее качество данных биоаккумуляции. В общем случае доверительные интервалы для значе-
ний BAF в хорошо спланированных исследованиях не должны превышать 25 % [5].

Отчет о проведении испытания должен содержать следующую ниже информацию.

Оценка результатов:

Приложение А
(справочное)

Виды олигохет, рекомендованные для использования в исследовании биоаккумуляции

А.1 Tubifex tubifex (MULLER), Tubificidae, Oligochaeta

Трубочник обыкновенный (Tubificidae, Oligochaeta) Tubifex tubifex (MULLER) обитает в пресноводных
донных отложениях в трубчатых норках, которые строит из слизи. Черви зарывают передний конец тела в норки
(трубы), поглощают частицы осадка, питаясь находящимися в нем микроорганизмами и органическими остатка-
ми. Задняя часть тела червя обычно выставлена над поверхностью грунта для дыхания. Хотя данный вид олиго-
хет обитает во множестве различных типов донных отложений во всем Северном полушарии, Tubifex tubifex
предпочитает субстрат с относительно мелкими размерами частиц (59]. Пригодность данного вида для эко-
токсикологических испытаний описана, например, в [8], [29], [31], [39], [60], [62], [63]

Методы культивирования

Для получения достаточного количества Tubifex tubifex для проведения исследования биоаккумуляции
червей необходимо постоянно выращивать в лаборатории. Для культивирования Tubifex tubifex рекомендуется
использовать систему, состоящую из искусственного осадка на основе искусственной почвы в соответствии с [40]
и реконструированной воды в соответствии с [25], [8]

В качестве сосудов для культивирования могут быть использованы стеклянные контейнеры или контей-
неры из нержавеющей стали высотой от 12 до 20 см. 8 каждый контейнер загружают слой сырого искусственного
осадка, приготовленного, как описано в приложении D. Глубина слоя осадка должна обеспечивать естественное
роющее поведение червей (минимальная глубина для Tubifex tubifex - 2 см). В систему добавляют реконструи-
рованную воду Воду следует добавлять осторожно, чтобы не нарушить целостность осадка. Вода аккуратно
аэрируется (например, 2 пузырька в секунду 0,45 мкм профильтрованным воздухом) с помощью пипетки Пасте-
ра, установленной на расстоянии 2 см от поверхности грунта. Рекомендуемая температура культуры составляет
(20 ±2) °C.

Червей вносят в систему для культивирования с максимальной загрузкой 20 000 особей/м2 поверхности
осадка. Более плотная загрузка может привести к сокращению скорости роста и размножения [43].

В искусственных осадках червей необходимо кормить. Питание состоит из измельченного корма для
рыб.

Пример - Tetra Min® может служить в качестве дополнительного питания [8].

Количество корма должно обеспечить достаточный рост и размножение червей и не приводить к накоп-
лению аммиака и росту грибка в культуре. Пища может быть внесена два раза в неделю (например, 0,6 - 0,8
миллиграмм на квадратный сантиметр поверхности грунта). Практика показывает, что применение суспензии
корма в гомогенизированной, деионизированной воде может способствовать равномерному распределению пи-
щи на поверхности осадка в контейнерах для культивирования. Чтобы избежать накопления аммиака, поверхно-
стную воду необходимо менять автоматически (проточная система) или по крайней мере раз в неделю вручную.
Субстрат для культуры следует заменять каждые три месяца.

Отбор проб червей может осуществляться путем просеивания осадка с культурой через сито с диамет-
ром ячеек 1 мм. если требуются только взрослые особи. Для сохранения коконов используют сито с диаметром
ячеек 0,5 мм, а для ювенильных особей - сито с диаметром ячеек 0,25 мм. Сита могут быть помещены в рекон-
струированную воду после просеивания осадка. Червей удаляют из сита, они могут быть отобраны из воды с
помощью мягкого стального пинцета или пипетки с оплавленными краями.

Для теста или нового культивирования используют только неповрежденные и четко идентифицирован-
ные образцы Tubifex tubifex(HanpHMep. [64]). Больных и поврежденных червей, а также коконы, зараженные гриб-
ком, необходимо удалять.

Синхронизированная культура может служить источником червей определенного возраста в подходящие
промежутки времени, когда это необходимо. Новые сосуды для культивирования устанавливаются в выбранные
интервалы (например, каждые две недели), начиная с организмов определенного возраста (например, коконов).
8 условиях культивирования, описанных здесь, черви считаются взрослыми через восемь - десять недель. Ма-
точную культуру можно отобрать, когда черви закладывают новые коконы, например, по прошествии десяти не-
дель. Взрослые особи могут быть использованы для теста, после чего запускают новое культивирование.

А.2 Lumbriculus variegatus (MULLER), Lumbriculidae, Oligochaeta

Lumbriculus variegatus (Lumbriculidae, Oligochaeta) также обитает в пресноводных донных отложениях по
всему миру и широко используется в эко-токсикологических экспериментах Информация о биологии, условиях
культивирования и чувствительности вида может быть получена из [1],[6).[9],[36]. Lumbriculus variegatus также
может быть культивирован на искусственном осадке, рекомендованном для Tubifex tubifex [8] при определенных
ограничениях. Так, в природе Lumbriculus variegatus предпочитает более грубый субстрат, чем Tubifex tubifex [59],
лабораторные культуры с искусственным осадком, рекомендуемым для Tubifex tubifex, могут погибнуть после
четырех - шести месяцев Практический опыт показывает, что Lumbriculus variegatus может содержаться в пес-
чаном грунте (например, кварцевом песке, мелком гравии) в проточной системе с кормом для рыб в качестве
источника питания в течение нескольких лет без обновления субстрата. Главным преимуществом Lumbriculus
variegatus по сравнению с другими водными видами олигохет является его быстрое размножение в результате
быстрого роста биомассы в лабораторных популяциях (1], [6], [9], (10].

Методы культивирования

Условия культивирования для Lumbriculus variegatus подробно изложены в [10], [28], [1], [6]. Краткое ре-
зюме данных условий приведено ниже. Червей можно культивировать в больших аквариумах (57 - 80 л) при 23
°C с фотопериодом (16 ч свет, 8 ч темнота при 100 - 1000 лк) с использованием ежедневно обновляемой при-
родной воды (45 - 50 л в аквариуме) Субстрат готовят за счет разрезания небеленой коричневой бумаги на по-
лоски, которые затем могут быть смешаны с водой для культивирования на несколько секунд для получения ма-
леньких кусочков бумажного субстрата Данный субстрат может быть непосредственно использован в аквариу-
мах для культивирования Lumbriculus variegatus, покрывая нижнюю часть аквариума, или может храниться в за-
мороженном виде в деионизированной воде для последующего использования. Субстрат, как правило, обновля-
ется один раз в два месяца

Каждая новая культура начинается с 500 -1000 червей, для кормления используют 10 мл суспензии, со-
держащей 6 г корма для форели, три раза в неделю в проточных или обновляемых условиях. Статические или
полустатические культуры должны получать меньшее количество корма для предотвращения бактериального и
грибкового роста. Корм и бумажный субстрат должен быть проанализирован на содержание химических веществ,
которые будут использованы в тесте на биоаккумуляцию.

В этих условиях количество особей в культуре, как правило, удваивается примерно в течение 10 - 14
дней.

Lumbriculus variegatus может быть удален из культуры, например, путем просеивания субстрата мелким
ситом или отбором отдельных особей с использованием стеклянной пипетки с широким концом (около 5 мм в
диаметре) в отдельный стакан. Если субстрат также переносят в данный стакан, стакан, содержащий червей и
субстрат, выдерживают в течение ночи в проточных условиях, что позволяет удалить субстрат из стакана в то
время, когда черви остаются на дне сосуда. Затем они могут быть перенесены во вновь подготовленные аква-
риумы для культивирования или использоваться для испытаний, как указано е [1] и [6]. Следует не допускать
повреждения червей, например, при использовании пипетки с оплавленными краями или шпателя из нержавею-
щей стали для отбора червей.

Критическим моментом при использовании Lumbriculus variegatus в испытаниях биоаккумуляции являет-
ся его режим воспроизводства (архитомия с последующим морфалпаксисом). Такое бесполое размножение при-
водит к получению двух фрагментов, которые не питаются в течение определенного периода, пока не произой-
дет регенерация передней или задней части тела (например, [36], [37]). Это означает, что потребление
Lumbriculus variegatus отложений и загрязнений с приемом пищи не может проходить непрерывно, как в случае с
трубочниками, которые не размножаются путем фрагментации.

Таким образом, синхронизация должна быть выполнена для минимизации неконтролируемого размно-
жения и регенерации, а также для последующей высокой изменчивости результатов испытания Такие изменения
могут произойти, когда некоторые особи, фрагментированные и, следовательно, не потребляющие пищу в тече-
ние определенного периода времени, в меньшей степени подвержены воздействию исследуемого вещества, чем
другие особи, которые не размножались во время испытания (например. [38]).

Черви должны пройти искусственную фрагментацию (синхронизацию) [65] за 10-14 дней до начала
экспозиции. Следует использовать больших червей, которые предпочтительно не имеют признаков недавней
фрагментации. Этих червей можно поместить на предметное стекло в каплю воды для культивирования и фраг-
ментировать в средней части тела с помощью скальпеля.

Задние части тела должны быть одинакового размера и оставлены для регенерации в сосуде со средой
для культивирования, содержащей тот же субстрат, который использовался при выращивании и реконструиро-
ванной воде, до начала экспозиции.

Регенерация новой передней части регистрируется, когда синхронизированные черви закапываются в
субстрат (наличие регенерации передней части тела может быть подтверждено путем проверки представитель-
ной подвыборки под бинокулярным микроскопом) Считается, что после этого тестовые организмы находятся в
одинаковом физиологическом состоянии. Это означает, что при регенерации морфаллаксис происходит у син-
хронизированных червей во время испытания, практически все особи, как ожидается, будут в равной степени
подвержены воздействию осадка с исследуемым веществом.

Кормление синхронизированных червей должно качаться, как только черви начнут зарываться в суб-
страт или через семь дней после фрагментации. Режим кормления должен соответствовать режиму для регу-
лярных культур, кормить синхронизированных червей можно тем же кормом, который будет использован в испы-
тании. Червей необходимо содержать при температуре (20 ± 2) °C. После регенерации неповрежденных целых
червей одинакового размера, активно плавающих или ползающих после механического раздражения, следует
использовать в испытании. Повреждения червей следует не допускать, например, при использовании для отбора
червей пипетки с оплавленными краями или шпателя из нержавеющей стали.

При использовании Lumbriculus variegatus в испытании в связи с особенностями режима воспроизводст-
ва данного вида во время теста должно происходить увеличение количества червей, если условия являются
подходящими [6]. Отсутствие воспроизводства в эксперименте биоаккумуляции с Lumbriculus variegatus должно
быть зарегистрировано и учитываться при интерпретации результатов испытания.

А.З Branchiura sowerbyi (BEDDARD), Tubificidae, Oligochaeta (не проверялись в межлабораторном
тесте)

Branchiura sowerbyi обитает в различных типах донных отложений водоемов, озер, прудов и рек, изна-
чально в тропических районах Черви данного вида могут быть также обнаружены в теплых водоемах Северного
полушария. Тем не менее они более распространены в илистых отложениях с высоким содержанием органиче-
ских веществ. Кроме того, данные черви живут в осадках сточных вод. Задней частью тела черви, как правило,
закапываются в субстрат. Этот вид легко определить по жаберным лепесткам на задней части. Взрослые особи
могут достигать в длину 9 - 11 см и массы 40 - 50 мг Черви обладают высокой скоростью размножения, показы-
вают удвоение популяции менее чем за две недели в условиях температуры и кормления, описанных ниже
(Aston et al, 1962, [65]). Branchiura sowerbyi использовались как в исследованиях токсичности, так и биоаккумуля-
ции (Marchese & Brinkhurst 1996, (31], Roghair et al. 1996, (67] соответственно).

Методы культивирования

Для культивирования тестовых организмов не требуется использование специальной техники. Организ-
мы могут культивироваться с использованием незагрязненных природных осадков (31]. Практический опыт пока-
зывает, что среда, состоящая из природного ила и песка, больше подходит для червей по сравнению с чистым
природным илом (32],(67]. Для культивирования могут быть использованы трехлитровые стаканы, содержащие
1500 мл осадка в воде, состоящей из 375 мл природного незагрязненного ила (около 10 % общего органического
углерода, около 17 % частиц диаметром менее или равным 63 мкм), 375 мл чистого песка (например. М32) и 750
мл реконструированной или дехлорированной водопроводной воды (31], (32], (67]. Бумажные фильтры также мо-
гут быть использованы в качестве субстрата для культивирования, но прирост популяции будет ниже, чем в ес-
тественном субстрате В полустатических системах слой воды в стакане медленно аэрируют, а поверхностная
вода должна обновляться один раз в неделю.

Каждый стакан содержит 25 молодых червей до начала культивирования. По прошествии двух месяцев
больших червей удаляют из осадка пинцетом и помещают в новый стакан со свежеприготовленной средой из
субстрата и воды В старом стакане также содержатся коконы и молодые черви. Таким образом, может быть
отобрано до 400 молодых червей на стакан. Взрослые черви могут быть использованы для воспроизводства в
течение не менее одного года.

Культуру нужно содержать при температуре от 21 °C до 25 °C. Изменение температуры не должно пре-
вышать + 2 °C. Время, необходимое для эмбрионального развития от отложения яйца до раскрытия кокона, со-
ставляет около трех недель при температуре 25 ’С. Плодовитость, полученная от одного червя Branchiura
sowerbyi, находится в диапазоне от 6,36 (31] до 11,2 (30] в иле при 25 X. Число яиц в коконе колеблется от 1,8 до
2,8 (66], [69] или до 8 (68].

Содержание растворенного кислорода, жесткость воды, температура и pH должны измеряться ежене-
дельно. Корм для рыб (например, TetraMin®) можно добавлять в виде суспензии два или три раза в неделю без
ограничений. Червей также можно кормить листьями салата ad libitum.

Главным преимуществом данного вида является высокая биомасса отдельных особей (до 40 - 50 мг сы-
рого веса). Поэтому данный вид может быть использован для испытаний биоаккумуляции тестируемых веществ
без радиоактивных маркеров Черви данного вида могут подвергаться воздействию в системах, используемых
для Tubifex tubifex или Lumbriculus variegatus с одной особью на пробу [11] Количество повторных проб должно
быть увеличено, если не используют большие тестовые камеры [11]. Кроме того, критерий достоверности, свя-
занный с роющим поведением, должен быть скорректирован для данного вида.

Приложение В
(рекомендуемое)

Расчет параметров поглощения и выведения

Основной конечной точкой испытания биоаккумуляции является BAF. Измеренный BAF может быть рас-
считан путем деления концентрации исследуемого вещества в тестовом организме Св на концентрацию иссле-
дуемого вещества в осадке Са в устойчивом состоянии. Если равновесные условия не достигаются во время фа-
зы поглощения, BAF рассчитывают таким же образом на 28-й день. Тем не менее следует указать, на чем осно-
вано значение BAF (на концентрации в равновесном состоянии или нет).

Наиболее предпочтительным способом для расчета кинетического фактора биоаккумуляции BAFk, кон-
станты скорости поглощения осадка М константы скорости выведения кс является использование нелинейного
метода оценки параметров С учетом временных серий средних значений фактора аккумуляции (СЛ, средние
значения для каждого времени отбора проб, деленные на Са, средние значения для каждого времени отбора
проб равны AF) фазы поглощения в расчете на сырой вес червя и осадка модельное уравнение выглядит сле-
дующим образом:

Л/'(/) = Я4/'»(1-ехр(^ •/)), (В.1)

где AF(t) представляет собой отношение концентрации исследуемого вещества в организме червя и его
концентрации в осадке в любой заданный момент времени t фазы поглощения, вычисляют значения BAFK, kt и
к$.

При достижении равновесного состояния в ходе фазы поглощения (те t = х ) уравнение 8.1 может
быть сведено к:

ВА!'К

к к

е . (В-2)

где ка - константа скорости поглощения в тканях (грамм осадка на килограмм червя в день);

ке - константа скорости выведения (день1).

т (’

Тогда — * С выражает подход к концентрации исследуемого вещества в тканях червя в равновесном
к.

состоянии (Ca.ss).

Фактор аккумуляции биота-осадок 8SAF должен быть рассчитан следующим образом:

(В.З)

где fee - фракция органического углерода в осадке е пересчете на сухой вес;

ft# - фракция липидов в червях, оба показателя - в расчете на сухой или на сырой вес.

С учетом временных серий значений концентраций кинетика выведения может быть смоделирована с
помощью следующих модельных уравнений и компьютерного расчета, основанного на нелинейном методе оцен-
ки параметров.

Среднее значение измеренного остаточного количества вещества в конце фазы поглощения рекоменду-
ется использовать в качестве основной отправкой точки. Использование значения смоделированного/оцененного
из фазы поглощения возможно только в случае, если измеренное значение значительно отличается от смодели-
рованного значения остатка в теле. См. также 7.3.7.2 для альтернативной предварительной экспозиции червей,
предназначенных для фазы выведения; в этом подходе образцы предварительно обработанных червей в день
нулевой фазы выведения считаются демонстрирующими реальные значения остатков в теле, с которых начина-
ется фаза выведения.

Если график зависимости экспериментальных данных от времени указывает на постоянное экспоненци-
альное снижение концентрации исследуемого вещества в тестовых организмах, однокомпонентная модель
[уравнение (В 5)] может быть использована для описания временного хода фазы выведения

C(/) = G.»exp(-^e')

Процессы выведения иногда оказываются двухфазными, демонстрируя быстрое снижение Са на ранних
стадиях, которое переходит в медленное удаление исследуемого вещества в поздних стадиях фазы выведения
[8], [19], [25]). Две фазы могут быть оценены с допущением, что в организме существуют два различных отдела.
из которых исследуемое вещество удаляется с различными скоростями. В этих случаях необходимо использо-
вать специальные источники информации [15], [16], [17], [25].

Двухфазные процессы выведения описываются, например, следующим уравнением [25)

Со = Л-ех^-е^^^+^-ех^-е^')

А и В соответствуют размерам отделов (в процентах от общего остатка в ткани),
где А - отдел с быстрым удалением вещества,

8 - с медленным удалением исследуемого вещества

Сумма Аид равна 100 % от общего обьема животных в стационарном состоянии. ка и кь представляют

Тем не менее данные модельные уравнения следует использовать с осторожностью, особенно если
происходят изменения в биодоступности во время испытания [42]

В качестве альтернативы модельным уравнениям, приведенным выше, кинетика {к* и kJ также может
быть рассчитана в одном испытании с применением модели кинетики первого порядка ко всем данным для фаз
поглощения и выведения вместе.

Неудаленный остаток NER должен быть рассчитан как вторичная конечная точка путем умножения соот-
ношения средней концентрации в черве Св на 10-й день фазы выведения фазы и средней концентрации в черве
Св в равновесном состоянии (28-й день фазы поглощения) на 100:

Приложение С
(справочное)

Некоторые физико-химические характеристики воды для разбавления

Таблица В. 1 - Содержание компонентов в воде для разбавления

Рекомендуемый состав реконструированной воды:

Растворяют 11,76 г СаСЬ 2НгО в деионизированной воде, доводят деионизированной водой до 1 л.

Растворяют 4.93 г MgSOdTH^ в деионизированной воде, доводят деионизированной водой до 1 л.

Растворяют 2,59 г ЫаНСОз в деионизированной воде, доводят деионизированной водой до 1 л.

Растворяют 0,23 г KCI в деионизированной воде, доводят деионизированной водой до 1 л.

Все химические вещества должны быть аналитической чистоты. Проводимость дистиллированной или
деминерализованной воды не должна превышать 10 мкСм/м.

25 мл каждого из растворов [(1) - (4)] смешивают и общий объем доводят деионизированной водой до 1
л. Сумма ионов кальция и магния в этом растворе составляет 2,5 ммоль/л.

Соотношение ионов Са Мд должно составлять 4 1 и ионов Na : К - 10*1. Кислотная емкость К^з этого
раствора составляет 0,8 ммоль/л.

Воду для разбавления аэрируют до насыщения кислородом, затем выдерживают ее в течение примерно
двух дней без последующей аэрации перед использованием. Значение pH воды должно находиться в диапазоне
от 6 - 9.

Приложение D
(рекомендуемое)

Искусственный осадок - рекомендации по подготовке и хранению

D.1 Общие сведения

Содержание торфа в искусственном осадке рекомендуется 2% сухого веса для того, чтобы соответство-
вать низкому или умеренному содержанию органических веществ в природных осадках (58).

Таблица 0.1 - Содержание сухих компонентов в искусственном осадке

Если ожидается повышение концентрации аммиака, например, если исследуемое вещество подавляет
процесс нитрификации, может быть полезно заменить 50 % богатого азотом порошка крапивы целлюлозой (на-
пример, порошком а-целлюлозы, химически чистым, размер частиц 6 0,5 мм).

0.2 Подготовка

Торф сушат на воздухе и измельчают в мелкий порошок (размер частиц менее или равен 0,5 мм, без ви-
димых растительных остатков), Суспензия необходимого количества порошка торфа готовится с использованием
порции деионизированной воды, добавляемой к сухому осадку (объем воды 11,5. умноженный на сухую массу
торфа, является приемлемым для подготовки суспензии торфа [8]) с использованием гомогенизирующего уст-
ройства.

pH данной суспензии доводят до (5,5 ± 0,5) СаСОз Суспензию выдерживают в течение не менее двух
дней при осторожном перемешивании при температуре (20 ± 2) X для стабилизации pH и установления устой-
чивого микробиологического фона. pH измеряют повторно и доводят до (6,0 ± 0,5) СаСОз, если это необходимо.
Затем все суспензии смешивают с другими сухими компонентами, отбирая порцию для внесения исследуемого
вещества. Оставшуюся деионизированную воду добавляют до получения однородного осадка pH измеряют сно-
ва и корректируют от 6,5 до 7,5 СаСОз, если это необходимо. Однако, если ожидается выделение аммиака, мо-
жет быть необходимо установить pH осадка ниже 7.0 (например, между 6,0 и 6,5). Образцы осадка отбирают для
определения сухого остатка и содержания органического углерода. Если ожидается выделение аммиака, искус-
ственный осадок может быть выдержан в течение семи дней в условиях последующего теста (например, при
соотношении осадок-вода 1:4, с высотой слоя осадка, как в тестовых сосудах) до внесения исследуемого веще-
ства. то есть осадок должен быть покрыт водой, которая должна быть аэрирована По окончании периода конди-
ционирования надосадочную воду удаляют. Отбирают образцы осадка для определения сухого веса и общего
содержания органического углерода (например, три пробы).

После этого кварцевый песок с исследуемым веществом смешивают с осадком для каждого испытания,
осадок распределяют по экспериментальным сосудам и добавляют тестируемую воду (например, соотношение
осадок - вода 1:4. высота слоя осадка, как в тестовых сосудах). Затем сосуды инкубируют при условии после-
дующих испытаний. В этот момент начинается период установления равновесия. Для надосадочной воды долж-
20

на быть проведена аэрация.

Выбранный источник пищи следует добавить до или во время внесения исследуемого вещества в оса-
док или первоначально смешать с навеской торфа. Чрезмерного разложения источника пищи до добавления
подопытных организмов (например, в случае длительного периода достижения равновесия) можно избежать,
сделав период времени между добавлением пищи и началом экспозиции как можно более коротким. Чтобы га-
рантировать, что пища хорошо контактирует с исследуемым веществом, источник пищи необходимо смешать с
осадком не позднее чем на следующий день после внесения тестируемого вещества в осадок. Исключения могут
быть сделаны в случае, если продолжительность периода достижения равновесия приводит к чрезмерной мик-
робиологической деградации пищи перед добавлением тестовых организмов Образцы осадка отбирают для
определения сухого веса и содержания общего органического углерода (например, три пробы осадка с иссле-
дуемым веществом или контрольного осадка).

Сухой вес компонентов (торф, песок, каолин) следует указывать в граммах и в процентах от общего су-
хого веса

Объем воды, добавленной к сухим компонентам в процессе подготовки осадка, следует также указывать
в процентах от общего сухого веса (например, 100 % сухого веса + 46 % воды означает, что на 1000 г сухого ве-
щества добавляют в общей сложности 460 мл воды, в результате получают 1460 г сырого осадка).

D.3 Хранение

Сухие компоненты искусственного осадка можно хранить в сухом, прохладном месте при комнатной
температуре. Подготовленный сырой осадок можно хранить (дальнейшее использование только для культивиро-
вания) при (4 ± 2) °C в темноте в течение от 2 до 4 недель со дня изготовления [8].

Осадок с внесенным в него исследуемым веществом следует использовать немедленно, если нет ин-
формации о том, что конкретный осадок можно хранить без влияния на токсичность и биодоступность исследуе-
мого вещества. Образцы осадка с исследуемым веществом можно хранить в условиях, рекомендованных для
конкретного исследуемого вещества

Приложение Е
(справочное)

Пример графика отбора проб в 28- дневном исследовании биоаккумуляции

Таблица Е. 1 - Фаза поглощения (включая четырехдневный процесс установления равновесия)

Таблица Е.2- Фаза удаления

Библиография

[31J Marchese, M.R. ABrinkhurst, R.O. (1996). A comparison of two tubificid species as candidates for
sublethal bioassay tests relevant to subtropical and tropical regions. Hydrobiologia 334,163-168

OECD, Paris

УДК 658.382.3:006.354 МКС 71.100.01 Т58

Ключевые слова: химическая продукция, воздействие на окружающую среду, окружающая среда,
биоаккумуляция, черви

Подписано в печать 01.04.2014. Формат 60x84’/*
Усл. леч. л. 3,72. Тираж 31 экэ. Зак. 1061.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ»

123995 Москва, Гранатный пер., 4.

www.gostinfo.ru info@gostinfo.ru