ГОСТ 32433-2013 Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Оценка биоразлагаемости органических соединений методом определения диоксида углерода в закрытом сосуде

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ
СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИИ ХИМИЧЕСКОЙ
ПРОДУКЦИИ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ
ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Оценка биоразлагаемости органических соединений
методом определения диоксида углерода в закры-
том сосуде

(OECD, Test No310:2006, IDT)

Издание официальное

Москва
Стандартинформ
2014

Предисловие

Цели, основные принципы и порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации
установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и
ГОСТ 1.2 - 2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные,
правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия,
применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

За принятие проголосовали:

Перевод с английского языка (еп).

Степень соответствия - идентичная (IDT)

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информа-
ционном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячном
информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или от-
мены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесяч-
ном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация,
уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на
официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в
сети Интернет

© Стандартинформ. 2014

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично вос-
произведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Феде-
рального агентства по техническому регулированию и метрологии

Введение

Общепризнанный метод (1], основанный на оригинальном тесте Штурма [2] для оценки биоло-
гического разложения органических химических веществ путем измерения образования углекислого
газа под воздействием микроорганизмов, обычно использовался в качестве основного метода для
тестирования плохо растворимых и сильно адсорбирующихся химических веществ. Он также приме-
нялся для тестирования растворимых (но не летучих) химических веществ, так как выделение углеки-
слого газа, по мнению многих специалистов, является единственным однозначным доказательством
деятельности микроорганизмов. На удаление растворенного органического углерода могут влиять
различные физико-химические процессы: адсорбция, испарение, осаждение, гидролиз, а также воз-
действие микроорганизмов и многие небиологические реакции, в которых происходит потребление
кислорода; в редких случаях СО2 образуется вследствие абиотического разложения органических
химических веществ. В оригинальном и модифицированном тесте Штурма [1], [2] СО2 удаляется из
жидкой фазы в поглощающие сосуды за счет барботирования (т.е. восходящий воздух пропускают
через жидкую среду для удаления СО?), а в варианте Ларсона [3], [4] СО2 переносится из реакционно-
го сосуда в поглотители за счет пропускания воздуха, не содержащего СОг, через свободное про-
странство сосуда, а также его непрерывного встряхивания.

При применении стандартного модифицированного теста Штурма для ряда химических ве-
ществ. неорганический углерод (НУ) накапливается в среде [9]. Концентрация НУ выше, чем 8 мг/л
была обнаружена в ходе тестирования анилина в концентрации 20 мг С/л. Таким образом, сбор СО2 в
щелочные ловушки не давал истинного представления о количестве СО2. образованного в результате
деятельности микроорганизмов в промежуточные интервалы в течение процесса разложения. В ре-
зультате, предел более 60 % от теоретического максимума образования СО2 (TI1CO2), который дол-
жен быть получен в течение «десятидневного интервала» (10 дней с момента достижения 10 % био-
разложения) для классификации исследуемого вещества, как легко биоразлагаемого, не может вы-
полняться для некоторых веществ, классифицируемых таким образом при использовании метода
удаления растворенного органического углерода (РОУ).

Если процент разложения меньше, чем ожидается, неорганический углерод, возможно, накап-
ливается в исследуемом растворе.

Другие недостатки методологии Штурма (громоздкость, трудоемкость, большая предрасполо-
женность к погрешности и неприменимость для летучих веществ) ранее привели к необходимости
поиска техник с использованием закрытых сосудов, за исключением метода Гледхилла, в основном
газовых проточных методов [10], [11]. Количество СО2 измерялось с помощью газовой хроматографии
/ анализатора неорганического углерода в автоматически отбираемых пробах газовой фазы, но рас-
творенный неорганический углерод (РНУ) в жидкой фазе не принимался во внимание. Кроме того, в
тесте использовались очень маленькие сосуды (20 мл), содержащие только 10 мл среды, что вызы-
вало проблемы, например, при необходимости добавления очень малых количеств нерастворимых
веществ, и/или вследствие отсутствия или недостаточного количества микроорганизмов в инокуляте
для приемлемого разложения исследуемого вещества.

В первом методе [13] СО2 измеряется в свободном пространстве после подкисления и уста-
новления равновесия, а во втором [14] содержание РНУ было измерено в газовой и жидкой фазе, без
обработки; более 90 % образовавшегося НУ присутствовало в жидкой фазе. Оба метода имели пре-
имущества по сравнению с тестом Штурма за счет более компактной и управляемой тестовой систе-
мы. возможности исследовать летучие химические вещества и отсутствия задержки, при измерении
образовавшегося СО2.

ГОСТ 32433—2013

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ ДЛЯ
ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Оценка биоразлагаемости органических соединений методом определения диоксида угле-
рода в закрытом сосуде

Testing of chemicals of environmental hazard.

Ready biodegradability - CO2 in sealed vessels

Дата введения — 2014—08—01

В настоящем стандарте представлен метод для оценки способности химических веществ к
биоразложению. Химические вещества, которые в данном испытании показывают положительные
результаты, могут рассматриваться как поддающиеся биологическому разложению и, следовательно,
быстрому разложению в окружающей среде.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определения-
ми.

Издание официальное

Для вычисления процента биоразложения должно быть известно содержание органического
углерода (масс, процент) в исследуемом веществе, измеренное или рассчитанное из его химической
структуры. В случае летучих исследуемых веществ, для определения подходящего соотношения сво-
бодного пространства и объема жидкости, необходимо измерить или рассчитать константу Генри.
Информация о токсичности исследуемого вещества для микроорганизмов полезна при выборе соот-
ветствующей тестовой концентрации и для интерпретации результатов, свидетельствующих о незна-
чительном биологическом разложении: рекомендуется также проводить контроль ингибирования, ес-
ли не известно, что исследуемое вещество не подавляет деятельность микроорганизмов (см. пункт
4.10).

Метод применим для растворимых в воде и нерастворимых веществ, для которых в свою оче-
редь должна обеспечиваться хорошая дисперсия вещества. Рекомендуется использовать соотноше-
ние свободного пространства к объему жидкости, равное 1:2, летучие вещества с константой Генри
до 50 Па-мкмоль'1 могут тестироваться, если содержание вещества в свободном пространстве сосу-
да не будет превышать 1 % [13]. Меньший объем свободного пространства может использоваться при
тестировании веществ, которые являются более летучими, но их биодоступность может быть ограни-
чена. особенно если они плохо растворимы в воде. Исполнители должны убедиться, что соотношение
свободного пространства и объема жидкости, и концентрация исследуемого вещества таковы, что
для полного аэробного биоразложения доступно достаточное количество кислорода (например, избе-
гать использования высоких концентраций субстрата и малых объемов свободного пространства).

Для проверки тестовых процедур параллельно должно быть протестировано стандартное ве-
щество с известной биоразлагаемостью. Для этой цели при тестировании растворимых 8 воде иссле-
дуемых веществ могут использоваться анилин, бензоат натрия или этиленгликоль и при тестирова-
нии плохо растворимых веществ - 1 - октанол [13]. Биоразложение данных веществ должно достигать
более 60 % от ТНУ в течение 14 дней.

Таблица 1- Показатели воспроизводимости при концентрации 20 мг-С/л

Таблица 2 - Показатели воспроизводимости при концентрации 10 мг-С/л

Результаты показывают, что, как правило, изменчивость была выше для менее склонных к
разложению ПАВ. Внутритестовая изменчивость была менее 15 % для более, чем 90 % случаев, са-
мая высокая изменчивость достигала от 30 % до 40 %.

Примечание - Большинство поверхностно-активных веществ представляют собой смесь изоме-
ров. гомологов и пр. которые разлагаются после различных лаг-фаз и с разными кинетическими скоростями, в
результате получаются «размытые» сглаженные кривые так, что проходное значение 60 % может не достигаться
в течение десяти дневного интервала, хотя для каждого отдельного вида молекул в индивидуальном испытании,
биоразложение достигнет > 60% в течение 10 дней. Подобное может также наблюдаться и для других сложных
смесей.

В тесте используется стандартное лабораторное оборудование, а также:

Используются реагенты аналитической чистоты.

Используется дистиллированная или деионизированная вода с содержанием общего органи-
ческого углерода менее или равной 1 мг/л, что должно составлять более или равной 5 % от первона-
чального содержания органического углерода, введенного в тесовый сосуд с рекомендованной дозой
исследуемого вещества.

Основные растворы и минеральные среды аналогичны растворам и средам, используемым в
[16] и [20].

Использование высокой концентрации хлорида аммония (2,0 г/л вместо 0.5 г/л) необходимо
только в самых исключительных случаях, например, когда концентрация исследуемого вещества бо-
лее 40 мг С/л. Основные растворы следует хранить в холодильнике и утилизировать по истечение
шести месяцев, или ранее, если наблюдаются признаки образования осадка или микробного роста.
Готовят следующие основные растворы:

Дикалия гидрофосфат (К2НРО4): 21,75 г;

Динатрия гидрофосфат дигидрат (Na2HPO4-0.2H2O): 33,40 г;

Хлорид аммония (NH4CI): 0,5 г.

Растворяют в воде и доводят до 1 литра. pH данного раствора должен составлять (7,4 ± 0,2).
Если это не так, готовят новый раствор.

Растворяют в воде и доводят до 1 литра.

Растворяют в воде и доводят до 1 литра.

Растворяют в воде, доводят до 1 литра и добавляют одну каплю концентрированного раство-
ра.

Смешивают 10 мл раствора [1] с приблизительно 800 мл воды (пункт 3.3), затем добавляют 1
мл растворов [2]. [3] и [4] и доводят водой до 1 литра (пункт 3.3).

Концентрированная ортофосфорная кислота (Н3РО4) (более 85 % массы к объему).

Растворяют 280 г гидроксида натрия (NaOH) в 1 литре воды (пункт 3.3). Определяют концен-
трацию растворенного неорганического углерода в данном растворе и используют данную величину
при расчете результатов испытания (пункты 5.7 и 6.3), особенно с учетом критериев достоверности
(пункт 6.5). Если концентрация растворенного неорганического углерода слишком высока, готовят
свежий раствор.

Готовят основной раствор исследуемого вещества в воде (пункт 3.3) или в тестовой среде
(пункт 3.5) 8 концентрации предпочтительно в 100 раз больше, чем окончательная концентрация, ис-
пользуемая в испытании; может быть необходимо отрегулировать pH основного раствора. Основной
раствор необходимо добавить к минеральной среде для получения окончательной концентрации ор-
ганического углерода от 2 и 40 мг С/л, предпочтительно 20 мг С/л. Если получаются концентрации
ниже указанных, то, возможно, была нарушена точность. Растворимые и нерастворимые жидкие ве-
щества могут быть добавлены непосредственно в тестовые сосуды с помощью шприцев высокой точ-
ности. Для плохо растворимых и нерастворимых веществ может потребоваться специальная подго-
товка (25).

Примеры

Материалы или растворители, используемые в способах 3, 4 и 5, должны быть исследованы
на любое ингибирующее или стимулирующее воздействие на активность микроорганизмов (пункт
S.3).

Готовят основной раствор (растворимого) стандартного вещества в воде (пункт 3.3) в концен-
трации предпочтительно в 100 раз больше, чем окончательная концентрация, которая будет исполь-
зоваться (20 мг С/л) в испытании.

Исследуемые вещества часто не демонстрируют значительного разложения в условиях испы-
тания на биоразложение. Одной из возможных причин является то, что исследуемое вещество может
быть ингибитором инокулята в концентрации, используемой в испытании. Проверка на ингибирование
может быть включена в структуру испытания для облегчения идентификации (в ретроспективе) инги-
бирования, как возможной причины или способствующего фактора низкого биоразложения. В альтер-
нативном случае проверка на ингибирование может исключить подобное влияние и продемонстриро-
вать, что нулевое или незначительное ухудшение объясняется исключительно неподатливостью ис-
следуемого вещества к микробиологическому воздействию в условиях испытания. Для получения
информации о токсичности исследуемого вещества для (аэробных) микроорганизмов готовят раствор
в тестовой среде, содержащей исследуемое вещество и стандартное вещество (пункт 3.5), каждое в
добавленной тестовой концентрации, соответственно (пункты 4.8 и 4.9).

Примечание - Активный ил и сточные воды, содержащие патогенные микроорганизмы, необхо-
димо использовать с осторожностью.

Образец отбирают из соответствующих поверхностных вод. Образец следует содержать в
аэробных условиях и использовать в день отбора. При необходимости, образец можно сконцентриро-
вать путем фильтрации или центрифугирования. Объем инокулята, используемый для каждого тесто-
вого сосуда, должен соответствовать критериям, приведенным в пункте 4.12.

Образец почвы отбирают из соответствующих почв, собранных на глубине до 20 см ниже
уровня поверхности. Перед просеиванием через 2 мм сито необходимо удалить из образца камни,
остатки растений и беспозвоночных (если образец слишком влажный для просеивания, его частично
сушат на воздухе). Образец следует содержать в аэробных условиях и использовать в день отбора
(если образец перевозится в неплотно закрытом черном полиэтиленовом пакете, его можно хранить
при температуре от 2 *С до 4 °C в пакете в течение не более одного месяца).

Посевная культура может быть предварительно подготовлена к условиям испытания, но не
адаптирована к исследуемому веществу. Предварительная подготовка позволяет снизить образова-
ние СО2 в контрольных пробах. Предварительная подготовка состоит из аэрации активного ила после
разведения в тестовой среде до 30 мг/л влажным не содержащим СОг воздухом в течение от 5 до 7
дней при температуре испытания.

5. Порядок проведения испытания

Посевная культура используется в концентрации 4 мг/л сухого остатка активного ила. Доста-
точное количество привитой среды готовят непосредственно перед использованием, например, путем
добавления 2 мл подготовленного активного ила (пункт 4.12) с концентрацией 2000 мг/л к 1 л среды
из минеральных солей (пункт 4.5). При использовании вторичных сточных вод добавляют до 100 мл
сточных вод (пункт 4.13) к 900 мл среды из минеральных солей (пункт 4.5) и доводят до 1 литра сре-
дой.

а) тестовые сосуды (обозначают как FT), содержащие исследуемое вещество;

б) контрольные сосуды (обозначают как FB), содержащие только тестовую среду и инокулят;
любые химические вещества, растворители, агенты или фильтры из стекловолокна, используемые
для введения исследуемого вещества в испытательные сосуды, также необходимо добавлять;

в) сосуды (обозначают как FC), содержащие стандартное вещество, для проверки процедуры
испытания;

г) при необходимости, сосуды (обозначают как FI), содержащие исследуемое и стандартное
вещества в тех же концентрациях, как в сосудах FT и FC соответственно;

д) сосуды (обозначают как FS) для проверки возможного абиотического разложения как 1 + 50
мг/л НдСЬ или стерилизованных каким-либо другим способом (например, в автоклаве).

Способ отбора проб будет зависеть от лаг фазы и кинетической скорости биоразложения ис-
следуемого вещества. Сосуды исключают из испытания в день отбора пробы, который должен проис-
ходить. как минимум, один раз в неделю или чаще (например, два раза в неделю), если требуется
полная кривая биоразложения. Для этого необходимое количество параллельных сосудов, представ-
ляющих Ft, Fb и Fc, и, если используются. Fi и F$, извлекают из шейкера (пункт 5.3). Испытание обыч-
но проводят в течение 28 дней. Если кривая биоразложения показывает, что плато-фаза была дос-
тигнута ранее, чем через 28 дней, испытание может быть закончено раньше. Отбирают пробы из пяти
сосудов, оставшихся на 28 день испытания, для анализа и используют результаты для расчета дове-
рительного интервала или коэффициента вариации для биоразложения в процентах. Пробы из сосу-
дов для проверки на ингибирование и для абиотического разложения не должны отбираться так же
часто, как из других сосудов, достаточно отбирать пробы в первый и 28 день испытания.

Поскольку методы могут давать немного разные результаты, в ходе испытания необходимо исполь-
зовать только один метод.

Готовят сосуды, содержащие 5 и 10 мг/л НУ с использованием раствора безводного карбоната
натрия (Na?CO3) в воде, не содержащей СО2 и подкисленной до pH 6,5 концентрированным раство-
ром ортофосфорной кислотой (пункт 4.6), барботируют в течение ночи воздухом, не содержащим
СО?, и повышают pH до нейтрального значения путем добавления щелочи. Обеспечивают, чтобы со-
отношение объема свободного пространства и объема жидкости было таким же, как в испытаниях
(например, 1:2). Подкисляют и приводят к равновесию, как описано в пункте 5.6, и измеряют концен-
трации НУ в свободном пространстве и жидкой фазе. Проверяют, что концентрации одинаковы в пре-
делах ошибки эксперимента. Если это не так. исполнитель должен пересмотреть тестовые процеду-
ры.

Эта проверка на распределение НУ между жидкой и газовой фазами не обязательно должна
проводиться каждый раз, когда проводится испытание; она предположительно может быть проведена
при выполнении калибровки.

щелочи), фильтровать через мембрану и подавать в анализатор РОУ. Эти сосуды могут использо-
ваться для других анализов, при необходимости, для измерения основного биологического разложе-
ния.

6 Данные и отчет о проведении испытания

ТНУ равно ООУ.

Общая масса (мг) неорганического углерода (ОНУ) в каждом сосуде:

ОНУ = (мг С в жидкости + мг С в свободном пространстве)

ОНУ = (К, С, ) + (К„ ■(’„), (1)

где VL - объем жидкости в сосуде, л;

CL - концентрация НУ в жидкости, мг/л углерода:

VH - объем свободного пространства, л;

Сн - концентрация НУ в свободном пространстве, мг/л углерода.

Расчет ОНУ для двух аналитических методов, используемых для измерения НУ в данном ис-
пытании, приведены ниже в пунктах 6.2 и 6.3

Процент биоразложения (% D) в каждом конкретном случае определяется по формуле:

где TIC- - ОНУ в тестовом сосуде в момент времени I, мг;

Т1СЬ - среднее значение ОНУ в контрольной пробе в момент времени t, мг;

ТОС - ООУ. первоначально добавленное в тестовый сосуд, мг.

Процент биоразложения, % D рассчитывается для исследуемого Ft, стандартного Fc веществ
и контроля ингибирования Fh при необходимости, из соответствующих количеств ОНУ, получаемых
для каждого времени отбора проб.

Поскольку подкисление до pH <3 и установление равновесия приводят к выравниванию кон-
центрации ОНУ в жидкой и газовой фазах, необходимо измерять только концентрацию НУ в газовой
фазе. Таким образом, из уравнения (1):

OHy = (rl + rH)c„=re.cff, (3)

где V'e - объем тестового сосуда.

8 данном методе расчеты выполняются как в уравнении (1), но не принимается в расчет не-
значительное количество НУ в газовой фазе, то есть

(4)

ОНУ = Г£СД (5)

Если в сосуде Fs (абиотическая проверка) наблюдается значительное увеличение (более 10
%) количества ОНУ, возможно, происходят абиотические процессы разложения:

Если данные ограничения не соблюдаются, испытание необходимо повторить с посевной
культурой из другого источника и/или пересмотреть используемые процедуры. Например, если в ис-
пытании получают высокие контрольные значения НУ, необходимо использовать процедуру, приве-
денную в пункте 4.12.

6.7.1 Составляют таблицу D (в процентах) для каждого исследуемого вещества (Ft), стан-
дартного вещества (Fc) и контроля ингибирования (FJ, если он проводится, для каждого дня испыта-
ния. Если для каждой параллельной пробы получены сопоставимые результаты, строят график зави-
симости средних значений D (в процентах) от времени. Регистрируют количество ОНУ в контрольных
пробах (F©) и РОУ и / или другие показатели в стерильных контрольных пробах (Fs) и их процентное
удаление.

Условия проведения испытания:

• ссылка на настоящее руководство;

Результаты:

Приложение А
(справочное)

Пример кривой биоразложения

Биоразложение (% ОНУЛГНУ)

30

Рисунок А1 - Кривая биоразложения 1-октанола

Библиография

(9J Weytjens, D. Van Ginneken, I and Painter, H.A. (1994) The recovery of carbon dioxide in the
Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere, 28, 801-812

Ключевые слова: химическая продукция, воздействие на окружающую среду, окружающая среда,
биоразлагаемость

Подписано в печать 01.04.2014. Формат 60x84’/&
Усл. печ. л. 2,32. Тираж 31 экз. Зак 1056

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

ФГУП «СТАЦЦАРТИНФОРМ»

123995 Москва, Гранатный пер., 4.

www.gostinfo.ru info@gostinfo.ru